Mejora de la termoestabilidad de la esterasa I de Pseudomonas fluorescens mediante selección de plegamiento in vivo en Thermus thermophilus
Palabras clave:
Evolución dirigida, Esterasa, Selección in vivo, Ingeniería de proteínas, Termoestabilidad, Thermus thermophilusResumen
La estabilidad prolongada es una propiedad deseada para la aplicación biotecnológica de enzimas ya que permite su reutilización, contribuyendo a que los procesos biocatalíticos sean económicamente más competitivos con respecto a la síntesis química. En este estudio hemos aplicado selección por interferencia de plegamiento a alta temperatura en Thermus thermophilus para obtener variantes termoestables de la esterasa I de Pseudomonas fluorescens (PFEI). La variante más termoestable (Q11L/A191S) mostró una temperatura de fusión (Tm) de 77,3 ± 0,1 °C (4,6 °C más que el tipo salvaje) y una vida media de más de 13 horas a 65 °C (7,9 veces mejor que el tipo salvaje), con parámetros cinéticos sin cambios. Las mutaciones estabilizadoras Q11L y A191S se incorporaron a la variante L30P de PFEI, descrita previamente como enantioselectiva en la hidrólisis del enantiómero (-) de la lactama Vince. La variante final Q11L/L30P/A191S mostró una mejora significativa en la estabilidad térmica (Tm de 80,8 ± 0,1 °C y una vida media de 65 min a 75 °C), mientras conservaba la enantioselectividad (E > 100). Los estudios estructurales revelaron que A191S establece una red de enlaces de hidrógeno entre una horquilla en forma de V y el dominio de hidrolasa α/β que conduce a una mayor rigidez y, por lo tanto, contribuiría a explicar el aumento de la estabilidad.
Descargas
Citas
Arnold, F. H. (1996). Directed evolution: Creating biocatalysts for the future. Chemical Engineering Science, 51, 5091–5102. https://doi.org/ 10.1016/S0009‐2509(96)00288‐6
Beer, H.‐D., Wohlfahrt, G., Schmid, R. D., & McCarthy, J. E. G. (1996). The folding and activity of the extracellular lipase of Rhizopus oryzae are modulated by a prosequence. Biochemical Journal, 319, 351–359. https://doi.org/10.1042/bj3190351
Bommarius, A. S., & Paye, M. F. (2013). Stabilizing biocatalysts. Chemical Society Reviews, 42, 6534–6565. https://doi. org/10.1039/c3cs60137d
Chautard, H., Blas‐Galindo, E., Menguy, T., Grand’Moursel, L., Cava, F., Berenguer, J., & Delcourt, M. (2007). An activity‐independent selection system of thermostable protein variants. Nature Methods, 4, 919–921. https://doi.org/10.1038/nmeth1090
Cheeseman, J. D., Tocilj, A., Park, S., Schrag, J. D., & Kazlauskas, R. J. (2004). Structure of an aryl esterase from Pseudomonas fluorescens. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, 60(7), 1237–1243. https://doi.org/10.1107/ S0907444904010522
Chen, C. S., Fujimoto, Y., Girdaukas, G., & Sih, C. J. (1982). Quantitative analyses of biochemical kinetic resolutions of enantiomers. Journal of the American Chemical Society, 104, 7294–7299. https://doi.org/10. 1021/ja00389a064
Choi, K. D., Jeohn, G. H., Rhee, J. S., & Yoo, O. J. (1990). Cloning and nucleotide sequence of an esterase gene from Pseudomonas fluorescens and expression of the gene in Escherichia coli. Agricultural and Biological Chemistry, 54, 2039–2045
Coates, J. A. V., Inggall, H. J., Pearson, B. A., Penn, C. R., Storer, R., Williamson, C., & Cameron, J. M. (1991). Carbovir: The (−) enantiomer is a potent and selective antiviral agent against human immunodeficiency virus in vitro. Antiviral Research, 15, 161–168. https://doi.org/10.1016/0166‐3542(91)90033‐n
Ding, Q. & Kazlauskas, R. J. (2017). Improving Pseudomonas fluorescens esterase for hydrolysis of lactones. Catalysis Science & Technology, 7, 4756–4765. https://doi.org/10.1039/c7cy01770g
Fisher, A. C. (2006). Genetic selection for protein solubility enabled by the folding quality control feature of the twin‐arginine translocation pathway. Protein Science, 15, 449–458. https:// doi.org/10.1110/ps.051902606
Fleming, P. J. & Rose, G. D. (2005). Do all backbone polar groups in proteins form hydrogen bonds? Protein Science, 14, 1911–1917. https://doi.org/10.1110/ps.051454805
Haki, G. & Rakshit, S. K. (2003). Developments in industrially important thermostable enzymes: A review. Bioresource Technology, 89, 17–34. https://doi.org/10.1016/s0960‐8524(03)00033‐6
Huang, J., Jones, B. J., & Kazlauskas, R. J. (2015). Stabilization of an α/β‐hydrolase by introducing proline residues: Salicylic acid binding protein 2 from tobacco. Biochemistry, 54, 4330–4341. https://doi. org/10.1021/acs.biochem.5b00333
Jochens, H., Aerts, D., & Bornscheuer, U. T. (2010). Thermostabilization of an esterase by alignment‐guided focussed directed evolution. Protein Engineering, Design & Selection, 23, 903– 909. https://doi.org/10.1093/ protein/gzq071
Jochens, H., Stiba, K., Savile, C., Fujii, R., Yu, J., Gerassenkov, Bornscheuer, U. T. (2009). Converting an esterase into an epoxide hydrolase. Angewandte Chemie International Edition, 48(19), 3532–3535. https://doi.org/10.1002/anie.v48:19
Jones, B. J., Lim, H. Y., Huang, J., & Kazlauskas, R. J. (2017). Comparison of five protein engineering strategies for stabilizing an α/β‐hydrolase. Biochemistry, 56, 6521–6532. https:// doi.org/10.1021/acs.biochem.7b00571
Khersonsky, O., & Tawfik, D. S. (2010). Enzyme promiscuity: A mechanistic and evolutionary perspective. Annual Review of Biochemistry, 79, 471–505. https://doi.org/10.1146/annurevbiochem‐ 030409‐143718
Krieger, E., & Vriend, G. (2014). YASARA View—molecular graphics for all devices‐from smartphones to workstations. Bioinformatics, 30, 2981–2982. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/ btu426
Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., & Magliery, T. J. (2009). High‐ throughput thermal scanning: A general, rapid dye‐binding thermal shift screen for protein engineering. Journal of the American Chemical Society, 131, 3794–3795. https://doi. org/10.1021/ja8049063
Mate, D. M., Gonzalez‐Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., & Alcalde, M. (2016). The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks. In G. Brahmachari (Ed.), Biotechnology of microbial enzymes: Production, biocatalysis and industrial applications (pp. 185–213). Cambridge, MA: Academic Press Elsevier. https://doi.org/ 10.1016/ b978‐0‐12‐803725‐6.00008‐x
Matthews, B. W., Nicholson, H., & Becktel, W. J. (1987). Enhanced protein thermostability from site‐directed mutations that decrease the entropy of unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 84, 6663–6667. https://doi.org/10. 2210/pdb1l23/pdb
Schließmann, A., Hidalgo, A., Berenguer, J., & Bornscheuer, U. T. (2009). Increased enantioselectivity by engineering bottleneck mutants in an esterase from Pseudomonas fluorescens. ChemBioChem, 10, 2920–2923. https://doi.org/10.1002/ cbic.200900563
Schrag, J. D., Li, Y., Cygler, M., Lang, D., Burgdorf, T., Hecht, H.‐J., McPherson, A. (1997). The open conformation of a Pseudomonas lipase. Structure, 5, 187–202. https://doi.org/10.1016/ s0969‐2126(97) 00178‐0
Schymkowitz, J., Borg, J., Stricher, F., Nys, R., Rousseau, F., & Serrano, L. (2005). The FoldX web server: An online force field. Nucleic Acids Research, 33, W382–W388. https://doi. org/10.1093/nar/gki387
Studier, F. W. (2005). Protein production by auto‐induction in high‐density shaking cultures. Protein Expression and Purification, 41, 207–234. https://doi.org/10.1016/j.pep.2005.01.016
Swarts, D. C., Jore, M. M., Westra, E. R., Zhu, Y., Janssen, J. H., Snijders, A. P., van der Oost, J. (2014). DNA‐guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute. Nature, 507, 258–261. https://doi.org/10.1038/ nature12971
Takahashi, S., Ueda, M., & Tanaka, A. (1999). Independent production of two molecular forms of a recombinant Rhizopus oryzae lipase by KEX2‐engineered strains of Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology, 52, 534– 540. https://doi.org/10.1007/s002530051556
Torres, L. L., Schließmann, A., Schmidt, M., Silva‐Martin, N., Hermoso, J. A., Berenguer, J., … Hidalgo, A. (2012). Promiscuous enantioselective (−) ‐ γ‐lactamase activity in the Pseudomonas fluorescens esterase I. Organic and Biomolecular Chemistry, 10, 3388–3392. https://doi.org/10.1039/ c2ob06887g
Waldo, G. S., Standish, B. M., Berendzen, J., & Terwilliger, T. C. (1999). Rapid protein‐folding assay using green fluores cent protein. Nature Biotechnology, 17, 691–695. https://doi. org/10.1038/10904
Watanabe, K., Masuda, T., Ohashi, H., Mihara, H., & Suzuki, Y. (1994). Multiple proline substitutions cumulatively thermostabilize Bacillus cereus ATCC7064 oligo‐1,6‐glucosidase. European Journal of Biochemistry, 226, 277–283. https://doi. org/10.1111/j.1432‐1033. 1994.tb20051.x
Wong, T., Zhurina, D., & Schwaneberg, U. (2006). The diversity challenge in directed protein evolution. CCHTS, 9, 271–288. https://doi.org/10. 2174/138620706776843192
Yin, D. L., Bernhardt, P., Morley, K. L., Jiang, Y., Cheeseman, J. D., Purpero, V., … Kazlauskas, R. J. (2010). Switching catalysis from hydrolysis to perhy- drolysis in Pseudomonas fluorescens esterase. Biochemistry, 49, 1931–1942. https://doi.org/10.1021/ bi9021268
Yin, D. T., Purpero, V. M., Fujii, R., Jing, Q., & Kazlauskas, R. J. (2013). New structural motif for carboxylic acid perhydrolases. Chemistry, 19, 3037–3046. https://doi.org/10.1002/ chem.201202027
Descargas
Publicado
Cómo citar
Número
Sección
Licencia
Esta obra está bajo una licencia internacional Creative Commons Atribución-NoComercial 4.0.
Los textos académicos y científicos que se publican en la Revista La Universidad están protegidos bajo la licencia CC BY NC SA 4.0, esta permite usar una obra para crear otra obra o contenido, modificando o no la obra original, siempre que se cite al autor, la obra resultante se comparta bajo el mismo tipo de licencia y no tenga fines comerciales (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/deed.es) . El autor es el único que pose los derechos de publicación y la Revista La Universidad posee los derechos de difusión.
